Меню Закрыть

Синтез белка из аминокислот это

Данное исследование посвящено развитию современных биотехнологических и химико-ферментативных методов по включению атомов дейтерия, углерода C 13 , азота N 15 и кислорода O 18 в молекулы аминокислот и белков. Рассмотрены потенциальные возможности этих методов для направленного синтеза изотопномеченых молекул аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных молекул с включенными стабильными изотопами в разнопрофильных биохимических исследованиях с применением методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, а также масс-спектрометрии.

Метод включения атомов стабильных изотопов ( 2 Н, 13 С, 15 N, 18 О) в молекулы — важное направление в биохимических и структурно-функциональных исследованиях разнообразных природных соединений и, в частности, аминокислот и белков. Молекулы этих изотопномеченых биологически активных соединений (БАС), полученные данным методом с различными уровнями изотопного обогащения, от селективно до униформно меченых, являются удобными инструментами для разнопрофильных метаболических и биохимических исследований, медицинской диагностики различных заболеваний, химических синтезов разнообразных изотопномеченых соединений на их основе.

Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной- и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие методов детекции стабильных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность проведения многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия многих клеточных БАС на молекулярном уровне, манипулируя атомами и конфигурациями молекул, что коррелирует с современными нанотехнологическими стандартами.

Разработка методов включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков, является актуальной задачей для современной биотехнологии и нанотехнологии, поскольку селективное введение атомов в молекулы может приводить к включению лишь одного отдельно выбранного атома по определённой позиции углеродного скелета молекулы. Это весьма перспективно и интересно для нанотехнологии, когда в полученной молекуле фигурирует лишь один или несколько атомов, замещённых на стабильные изотопы по определённым положениям молекулы.

Разные методы, используемые для введения стабильных изотопов в молекулы БАС, обычно приводят к получению продуктов, представляющих собой смеси молекул, различающихся количеством атомов, замещённых на стабильные изотопы. Поэтому необходимо разрабатывать и применять новые подходы по получению изотопномеченых БАС, основанные на использовании генно-инженерных методов, комбинации биотехнологических и химико-ферментативных подходов и т. п.

В зависимости от цели исследования при реализации того или иного подхода по получению изотопномеченых аминокислот и белков должны учитываться их стоимость, выходы, возможности более полного выделения и очистки, а также изотопная чистота синтезированных молекул.

При получении изотопномеченых молекул аминокислот и белков основные затраты связаны с закупкой сырья (субстрата), расходом электроэнергии (на перемешивание, аэрацию и процессы массопереноса) и охлаждением (теплообменом). При использовании природных сырьевых источников (пептонов, белково-витаминных концентратов и т. п.) в качестве субстратов для производства изотопномеченых БАС необходимо также учитывать расход электроэнергии, пара и топлива на предварительную глубокую обработку сырья, чтобы превратить его в поддающиеся микробиологическому воздействию соединения. Сравнительная оценка различных способов производства изотопномеченых аминокислот и белков показывает, что основные расходы связаны со стоимостью сырья, составляющей 70-80% всех затрат.

Использование молекул аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами, в значительной мере определяется ограниченной доступностью и дороговизной самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из различных природных источников. Природная распространенность стабильных изотопов варьирует от 0,015% (относительно общего количества элемента) для дейтерия 2 Н , до 1,11% для изотопа углерода 13 С, однако, несмотря на низкое содержание изотопов в пробах, разработанные в последние годы высокие методы обогащения и очистки стабильных изотопов позволяют получать молекулы изотопно-меченных субстратов с высокой степени изотопной чистоты.

Синтетические методы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот представляют собой модифицированный классический синтез аминокислот, в котором стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования или гидролиза проводят с использованием меченых реагентов, содержащих стабильные изотопы дейтерия, углерода 13 С, азота 15 N, и кислорода 18 O с соответствующим уровнем изотопной чистоты. Для синтеза [ 2 Н]-, [ 15 N]- и [ 18 О]аминокислот используется тяжёлая вода 2 Н2О , дейтероводород 2 H2, дейтерохлористоводороднная кислота 2 НCl; LiAl2H4; B2 2 H6 ; 15 NH3 ; Na 15 NH2 ; 15 NH2Cl, 18 H2O и др.

Главным недостатком химического синтеза является то, что он приводит к синтезу молекул [ 13 С]аминокислот, у которых атомы углерода 13 С локализуются по карбоксильным СООН-положениям молекул. Это существенно ограничивает использование полученных этим методом [ 13 С]аминокислот для биологических исследований вследствие возможной потери изотопной метки углерода 13 С за счёт функционирования многочисленных реакций ферментативного декарбоксилирования, происходящих в организме. Разработанные за последние годы синтетические методы введения атома углерода 13 С в молекулы аминокислот затрагивают такие положения углеродных атомов в молекулах аминокислот, как метильная группа метионина [1], С2 — положение в имидазольном кольце молекулы гистидина [2], а также атомы углерода при карбоксильных СООН- группах аспарагиновой [3], и глутаминовой кислот [4].

Несмотря на это, химические синтезы многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D— и L-форм молекул аминокислот, для разделения которых требуются специальные методы. Более тонкие способы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов.

Реакция изотопного ( 1 Н- 2 Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения и затрагивает определённые, наиболее чувствительные к замещению протоны в молекулах. При помещении молекулы в тяжёлую воду происходит быстрый изотопный ( 1 Н- 2 H)-обмен атомов водорода на дейтерий в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH группах. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С- 2 H могут синтезироваться de novo.

Этим методом могут быть получены в граммовых количествах дейтерированные ароматические аминокислоты — L-[2,3,4,5,6- 2 Н]фенилаланин в 85% 2 H2SO4 при 500 C, L-[3,5- 2 H]тирозин в 6 н. 2 H2SO4 при слабом кипячении раствора, L-[2,4,5,6,7- 2 H]триптофан в 75% [ 2 H]трифторуксусной кислоте при 250 С и L-[2- 2 H]гистидин в 6 н. NaO 2 H при 800 С.

Вследствие того, что замещаемые на дейтерий протоны в молекулах белков прочно связаны с атомами углерода и трудно обмениваются на дейтерий в мягких условиях, метод ограничен из-за нестабильности белков в жестких условиях (85-90% НCl/H2SO4, 80-1000 C), необходимых для проведения реакции изотопного обмена. Кроме того, проведение изотопного обмена в более жёстких условиях сопровождается рацемизацией аминокислот. Избежать этого позволяет непосредственное введение полученных за счёт ( 1 Н- 2 Н)-обмена дейтерированных аналогов аминокислот — L-[2,3,4,5,6- 2 Н]фенилаланина, L-[3,5- 2 H]тирозина и L-[2,4,5,6,7- 2 H]триптофана в молекулы индивидуальных белков, например, в бактериородопсин, синтезируемый бактерией Halobacterium halobium [5].

Имеются и другие интересные схемы реализации изотопного обмена, например, разработанный нашим соотечественником Ю. Золотарёвым метод включения атомов дейтерия в молекулы алициклических аминокислот (глицин, аланин, валин, изолейцин, серин, треонин, пролин, гистидин) реакцией высокотемпературного твёрдофазного каталитического изотопного обмена [6]. В соответствии с этим методом L-аминокислота в протонированой форме реагирует с газообразным дейтерием при 200-2500 С в присутствии высокодисперстного катализатора группы платины (Pt, Pd, Rh), и неорганического носителя (BaSO4, CaCO3, Al2O3).

С помощью изотопного обмена можно также включать изотоп кислорода-18 в молекулы аминокислот. Для этого используют реакцию изотопного ( 16 О- 18 О)-обмена по атомам кислорода карбоксильных СООН- групп в молекулах аминокислот в присутствии Н2 18 О в качестве источника метки. Использование этого метода лимитируется высокой стоимостью полученных таким способом [ 18 О]аминокислот. Однако, он полностью оправдывает себя при проведении многочисленных биомедицинских исследований с применением синтезированных молекул [ 18 O]аминокислот, так как они, в отличие от их дейтерированных аналогов, стабильны по отношению к обратному изотопному обмену. Например, [ 18 О]аминокислоты стабильно циркулируют в плазме крови в течении нескольких дней после инъекции: обратный изотопный ( 18 О- 18 О)-обмен по карбоксильным положениям в молекуле [ 18 О]тирозина и других молекулах [ 18 O]аминокислот проявлялся лишь при длительной инкубации клеток крови с питательной средой [7].

Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому способу включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению атомов изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы дейтерия 2 Н, углерода 13 С, азота 15 N и кислорода 18 О.

Решающее значение для биотехнологического введения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков имеет правильный выбор микроорганизмов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих стабильные изотопы и к продукции нужных БАС. Наиболее доступными объектами для получения многих изотопномеченых белков признаны микроводоросли, большое разнообразие которых в природе позволяет выбирать среди них отдельные виды, способные к эндогенному накоплению белков. В то же время комплексное использование компонентов меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, например, дейтерированные аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на тяжёловодородной среде.

Другие традиционные штаммы микроорганизмов также могут эффективно применяться для получения изотопно-меченых молекул аминокислот и белков. Основными требованиями к микроорганизмам, используемым для этих целей являются устойчивый рост на средах, содержащих стабильные изотопы и высокий уровень продукции нужных БАС, который можно повысить за счёт применения генно-инженерных методов, а также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с заданными свойствами и для дальнейшего изучения их характеристик. Биотехнологический подход экономически целесообразен и особенно незаменим, когда необходимы высокая стереоселективность и максимальные уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.

При биосинтетическом включении атомов стабильных изотопов в молекулы используют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении стабильными изотопами молекул клеточных БАС по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты и с последующим фракционированием компонентов биомассы на различные классы природных соединений.

Молекулы аминокислот с униформным характером включения атома углерода-13 по скелету молекулы получают, в основном, при выращивании автотрофных микроорганизмов на ростовых средах, содержащих вместо обычных углеродных субстратов их низкомолекулярные [ 13 С]аналоги, например 13 СО2. Этим методом были получены многие [ 13 C]белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena [8], цитохром C-553 [9], цитохром C2 из Rhodospirillum [10], и флаводоксин из Anabaena 7120 [11] и использованы для дальнейших ЯМР исследований.

Для структурных исследований белков методом спектроскопии ЯМР, для которого необходимо, чтобы как можно больше атомов в молекуле были замещены на их стабильные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых молекул [ 13 C]аминокислот могут обеспечить сравнительно недорогое получение нужного количества меченых [ 13 C]продуктов.

Включения атома азота 15 N в молекулы аминокислот добиваются аналогичным путём за счёт выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих К 15 NO3 или другие 15 N-содержащие соли, в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с использованием ростовых сред, содержащих вместо обычной воды 99,9% тяжёлой воды.

Существует ряд определённых трудностей при использовании тяжёлой воды в качестве источника атомов дейтерия, поскольку необходимо учитывать эффекты, связанные с клеточной адаптацией к ней. Известно, что тяжёлая вода действует токсически на клетки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микроорганизмов.

Однако, несмотря на негативный биостатический эффект тяжёлой воды, разные таксономические роды бактерий могут быть достаточно легко адаптированы к росту и биосинтезу на средах содержащих максимальные концентрации тяжелой воды [12], в то время как клетки высших растений способны выдерживать не более 60% тяжёлой воды [13], а животные клетки не более 30% [14].

С точки зрения физиологии и генетики адаптация клетки к тяжёлой воде является комплексным феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях молекул синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клетки. В связи с этим, разработка методов физиологической адаптации клетки к тяжёлой воде для получения высокообогащённых дейтерием молекул БАС является весьма актуальной задачей.

При адаптации биологических объектов к тяжёлой воде учитываются химические изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высокими. Различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей химических реакций, протекающих в тяжёлой воде по отношению к таковым в обычной воде, измеренных как соотношение kh /k 2 h. Это соотношение меняется для различных связей, образованных с участием дейтерия и может варьировать в пределах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся изменения в констатнах скоростей химических реакций, обусловленных действием 2 Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.).

Тяжёлая вода является гидроскопическим соединением, активно поглощающем пары влаги из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, следовательно, этапы, связанные с выращиванием бактерий на тяжёловодородных средах необходимо проводить в герметических условиях с использованием безводных реагентов, предварительно перекристаллизованных в тяжёлой воде неорганических солей и т. п.

Атомы изотопа кислорода 18 O можно включать в молекулы аминокислот за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды — Н2 18 O воду. Адаптация клеток к Н2 18 O не является лимитирующим этапом. Однако, Н2 18 O используется в качестве источника изотопной метки в редких случаях, вследствие высокой стоимости изотопных соединений кислорода.

Селективного включения атомов стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков достигается за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах [15], меченых предшественников аминокислот [16], или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов [17]. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм [18].

Очень часто, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клетке приводят к специфическому мечению других биосинтетически родственных молекул аминокислот за счёт использования клеткой многочисленных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В некоторых случаях этот фактор может существенно облегчить процесс включения атомов стабильных изотопов в молекулы селективно меченых белков и аминокислот.

Использование ауксотрофных по определённым аминокислотам форм микроорганизмов для включения атомов стабильных изотопов в молекулы стало настолько популярным в биотехнологии, что сегодня его следует рассматривать как отдельное направление. Селективность включения атомов стабильных изотопов в молекулы достигается в результате добавления в ростовую среду меченого аналога соответствующей аминокислоты или её предшественника, по которым штамм ауксотрофен и которые непосредственно или через de novo биосинтетический цикл предшественников заменяют в белке нативную аминокислоту. При этом ауксотрофные штаммы могут относиться к различным таксономическим группам микроорганизмов, включая метаногенные и метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых для получения изотопномеченых аминокислот в настоящее время общепризнан.

Метаногенные бактерии, относящиеся к группе облигатных анаэробов, которые получают энергию за счет ассимиляции газовой смеси (H2 -CO2) [19], чаще всего используют для включения изотопа углерода 13 C. Эффективность мечения аминокислот изотопом углерода 13 C достигается за счёт получения и использования ацетатзависимых мутантов метаногенных бактерий, неспособных синтезировать ацетил-СоА из СО2 и вследствие этого для роста которых необходим экзогенный ацетат. Поэтому выращивание этих бактерий проводят на ростовых средах, содержащих наряду с (H2 -CO2) добавки ацетата, которые могут заменяться их [ 13 С]аналогами. При росте этих метанотрофов на средах с (H2 — 13 CO2 диоксид углерода) и [ 13 C]ацетатом удаётся достичь униформного характера включения изотопа углерода 13 C по углеродным скелетам в молекулах аминокислот, а также резкого уменьшения уровня включения экзогенного 13 CO2 в конечный продукт ассимиляции углерода — метан. При этом удается почти полностью избежать процесса разбавления метки в молекулах синтезируемых [ 13 C]аминокислот.

Селективного включения атомов углерода 13 C в молекулы аминокислот можно достичь за счёт использования ростовых сред, содержащих немеченую смесь (Н2 -СО2) и [ 13 C]ацетат либо 13 CО2 в составе смеси (Н2— 13 CО2) и немеченый ацетат. Вследствие высокой стоимости 13 CO2 диоксида углерода и неудобств, связанных с его компрессией, включение атомов углерода 13 C в молекулы чаще всего осуществляют по первому варианту, т. е. с использованием смеси (Н2-СО2) и [ 13 C]ацетата. Однако, ацетатассимилирующим метанотрофам Methanospirillum hungatei требуются значительные концентрации ацетата для оптимального роста. Вследствие этого основным недостатком использования этих бактерий является значительный расход изотопной метки.

При биотехнологическом включении атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот необходимо учитывать пути их биосинтеза в клетке, которые для метаногенных бактерий хотя и являются характеристичными, но несколько отличаются от известных для E. coli. Данные по биосинтезу [ 13 C]аминокислот, полученных при выращивании ауксотрофной по ацетату бактерии M. hungatei в среде, содержащей (H2-CO2) и [1,2- 13 C]ацетат в качестве источников углерода и энергии, приведены ниже.

[ 13 C]Аланин. Включение атома изотопа углерода 13 C в молекулу аланина происходило за счет реакции карбоксилирования ацетил-СоА до пирувата. Такой путь биосинтеза был продемонстрирован для других таксономических родов и видов метаногенных бактерий [20].

[ 13 C]Серин и [ 13 C]глицин. Характер распределения атомов изотопа углерода 13 C в молекулах серина и глицина был объяснён частичным фосфорилированинем пирувата до фосфопирувата и образованием 3-фосфоенолпирувата по гликогенному пути ассимиляции углерода. Подтверждением этому служат значительные уровни активности ферментов- фосфоенолпируватсинтетазы, енолазы и 2-фосфоглицератмутазы, которые были обнаружены в клеточных экстрактах других метаногенов, например, Methanobacterium thermoautotrophicum [21].

[ 13 C]Аспарагиновая кислота, [ 13 C]треонин и [ 13 C]метионин. Включение атома изотопа углерода 13 C по атому углерода a-карбоксильной группы аспартата, происходящего из C1-ацетата и по b-углеродному атому С2-ацетата и включение атома изотопа углерода 13 C в карбоксильные группы аминокислот из диоксида углерода, свидетельствовало о том, что биосинтез аспартата в этой бактерии происходил через цикл трикарбоновых кислот в результате ферментативного карбоксилирования пирувата до оксалоацетата.

Распределение атомов изотопа углерода 13 C в молекулах треонина и метионина происходило в соответствии с путем биосинтеза этих аминокислот из аспартата. Атом углерода в метильной группе молекулы метионина происходил из диоксида углерода.

[ 13 C]Лизин. Распределение атома изотопа углерода 13 C в молекуле лизина свидетельствовало о том, что лизин синтезировался из пирувата и аспартата по типичному для бактерий диаминопимелиновому пути [22].

[ 13 C]Глутаминовая кислота, [ 13 C]аргинин и [ 13 C]пролин. В молекуле глутаминовой кислоты атомы изотопа углерода детектировались в Сb и Cy положениях углеродного скелета молекулы. Атомы углерода при карбоксильной СООН- группе молекулы глутаминовой кислоты и в a-положении происходили из диоксида углерода. Этот результат свидетельствовал о том, что цикл трикарбоновых кислот приводил к образованию a-кетоглутарата. Распределение атомов изотопа углерода 13 C в молекулах аргинина и пролина аналогично таковому в глутаминовой кислоте.

[ 13 C]Лейцин, [ 13 C]валин и [ 13 C]изолейцин. Характер изотопного включения углерода 13 C в молекулы лейцина и валина свидетельствовал об их образовании из a-ацетолактата, в то время как биосинтез изолейцина отличался от ожидаемого пути биосинтеза этой аминокислоты из треонина. В клетках M. hungatei изолейцин образовывался из ацетата. Аналогичный путь биосинтеза изолейцина был обнаружен у спирохеты [23], у лейцинассимилирующего мутанта Serratia marcescens [24], и у мутанта Saccharomyces cerevisiae, у которого дефектен ген треониндезаминазы [25].

[ 13 C]Фенилаланин и [ 13 C]тирозин. Меченые позиции атома углерода в молекулах фенилаланина и тирозина полностью совпадали с типичным для бактерий путем биосинтеза этих аминокислот из шикимовой и хоризмовой кислот [26].

[ 13 C]Гистидин. Атом углерода в положении Cg имидазольного кольца гистидина происходил из диоксида углерода. Углеродный атом в положении Сe имидазольного кольца гистидина был замещён на изотоп углерода 13 C с участием С2- ацетата.

Другими перспективными источниками изотопномеченых аминокислот и белков признаны метилотрофные микроорганизмы, способные ассимилировать метанол и C1-углеродные соединения по рибулозофосфатному и сериновому циклам ассимиляции углерода. Метилотрофы представленны в таксономическом аспекте грамположительными, грамотрицательными бактериями и дрожжами, интерес к которым в настоящее время все возрастает благодаря разработке новых технологий химического синтеза метанола. Эти бактерии привлекают внимание исследователей прежде всего как дешевые источники микробного белка и аминокислот. Знание путей бактериального метаболизма позволяет осуществлять направленное введение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот.

refdb.ru

Читай также:

Белок в сухом виде .   Аминокислоты комплексные для роста мышц .   Аминокислоты участвующие в синтезе белка .   Опасные для здоровья добавки .   Боль в мышцах после первой тренировки в тренажерном зале для .